Illumina测序数据研究

测序原理

sanger法测序及双脱氧链终止法，它采取DNA复制原理，通过在DNA复制过程中添加双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）终止DNA链的延伸，在DNA链不同位置的延伸终止判断该位置的碱基类型。但是凝胶电泳的时间较长，导致sanger法测序通量低。illumina测序技术可以实现高通量，低成本，测序长度较短。

桥式PCR，主要用于扩大信号，4色荧光可逆终止反应，使illumina测序可以实现边合成边测序的技术。但Illumina测序技术不能像第1代测序技术一样测500bp以上，一方面测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现50个红，50个绿色，这时信号不足以判断碱基类型，所以不支持长段测序。

Illumina测序技术细节

adapter

illumina测序过程中关键一步是将文库片段固定在flowcell上，然后通过桥式PCR将片段扩增，在被打断成300~500bp的长度的片段末端被补平后，adaptor将被添加到片段两端，用于将片段固定在flowcell上，同时adaptor中还包含桥式PCR所需要的引物。

桥式PCR

• 加上adaptor之后的DNA样品与flowcell上固定的oligo（寡链核苷酸）匹配后就被固定在flowcell上，通过桥式PCR进行扩增成cluster,便于后面的荧光测序。
• 第一轮扩增，将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。由于最开始的序列是使用化学键连接的，所以不会被洗。
• 加入缓冲溶液，这时候序列自由端的部分就会和旁边的oligo进行匹配。
• 进行一轮PCR，在PCR的过程中，序列是弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍；如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的cluster。
• 一条lane能测得的数据量在30G左右，而一个样品的测序量一般不会这么大，所以在建库的时候对每一种样品的接头加上不同的标签序列，这个标签就叫做Index，有了index就可以同时在一个lane中测多种数据了，后期可以根据index将数据分开。

边合成边测序SBS

经过桥式PCR之后同一段序列已经成簇，下一段就是开始进行测序，这一步比较简单，就是加入primer，然后添加经过特殊处理的ATCG四种碱基，特殊的地方有两点：一个是碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色，另一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证了每次只能够在序列上添加1个碱基。 这样每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。
adapter1-Index-fragment-adapter2，adapter2通过与oligo互补连接在flowcell上，在进行完桥式PCR之后进行测序时，添加primer，这一段primer的序列是与Index互补的而非adapter1，所以最终拿到的测序结果应该是Index+fragment+adapter2