GPCR概览

2024-09-20T20:09:58+08:00 | 9 分钟阅读 | 更新于 2024-09-20T20:09:58+08:00

Pepper

前沿

GPCR的定义

G蛋白偶联受体(GPCR)家族是最大和研究最多的细胞表面蛋白家族之一，在人类基因组中发现了近800个成员。GPCRs是七种跨膜受体蛋白，它们被一系列刺激物激活，包括蛋白质、肽、脂质、氨基酸、离子、生物胺、光和气味剂。

GPCR对一系列显着的细胞外刺激物作出反应，包括光、离子、激素、气味剂、神经递质和天然化学物质。

研究GPCR的激活

• Ki: 抑制常数(inhibition constant)，反映的是抑制剂对靶标的抑制强度，这个值越小说明抑制能力越强
  Ki为50%的酶被抑制剂结合时对应的游离抑制剂的浓度。IC50与实验中所用酶的浓度、底物浓度都有关，而Ki是不受这些变量的影响的。
• Kd:解离常数(dissociation constant)，反映的是化合物对靶标的亲和力大小，值越小亲和力越强
  K_d=K_off/k_on
  Kd为50%的酶被配体结合时对应的游离抑制剂的浓度，代表在平衡状态下，配体和受体相互作用的强弱。

由鸟嘌呤核苷酸结合蛋白发挥功能

GPCR在细胞外和细胞内环境之间形成一个重要的纽带，是细胞生理学和病理生理学的重要调节剂，该受体家族的突变或修饰与异常的细胞信号传导和疾病有关。主要与G蛋白偶联，以促进GTP与Ga亚基上的GDP的交换。通常用apyrase将G蛋白上的GTP水解成GDP，保持激活前构象，核苷酸交换促进了Ga-GDP从Gbr的解离下来。

GPCR激酶调节

a. 七种已知的哺乳动物GPCR激酶(GRK1-7)
b. 磷酸化活化GPCR的C末端尾部
c. 阻止与异源三聚体G蛋白的进一步相互作用并导致受体信号传导和受体脱敏的终止。

调节受体酪氨酸激酶（RTKs）

eg：EGFR可以被其他信号通路“劫持”，导致有丝分裂和细胞增殖的异常激活。GPCR信号转导导致EGFR的反式激活途径：
a. ADAM/MMP“三重膜传递信号”
其中GPCR介导的EGFR反式激活依赖于膜结合基质金属蛋白酶(MMP)的激活，例如ADAM(去整合素和金属蛋白酶)家族成员。这些分子能够切割EGF配体(如EGF、肝素结合EGF和神经调节蛋白)并促进配体脱落到细胞外空间，EGF配体随后能够与EGFR家族成员结合并促进EGFR的二聚化和激活，介导信号级联的激活，包括MAPK通路和PI3K-AKT通路，并引发下游细胞反应。
b.GPCR刺激后EGFR的直接磷酸化
这种磷酸化本质上是细胞内的，可能不依赖于或部分依赖于MMP和EGF配体的活性。大量证据表明，GPCR的刺激可能导致第二信使分子的激活，例如Ca2+、蛋白激酶C、蛋白酪氨酸激酶2(Pyk2)、Src、抑制素和活性氧，进而导致酪氨酸磷酸化以及随后激活EGFR。

研究价值与挑战

a. 可能为某些疾病提供新的治疗靶点，具有广阔的潜在应用前景。
b. 很多GPCR受体都是孤儿受体（没有已知的激动剂），这为研究带来了挑战。

肾上腺素受体 Adrenaline Receptor

结构研究timeline

2007年，斯坦福大学Kobilka实验室将一个抗体Fab5结合到β2AR第3个胞内环(Intracellular loop 3, ICL3)中，得到了稳定的受体晶体结构。β2肾上腺素受体的非激活态结构获得解析，结合反向激动剂卡拉洛尔的3.4 Å的配体–受体复合物晶体结构（PDB：2R4S）。这也是第一个人源G蛋白偶联受体的晶体结构。随后将T4溶菌酶插入到β2AR的ICL3胞内环中，又获得了2.4 Å高分辨率的配体-受体复合物晶体结构（PDB：2RH1）^[1]。

2008年，剑桥大学Gebhard F. X. Schertler实验室解析火鸡的 β1-adrenergic CYANOPINDOLOL结合的非激活态晶体结构(PDB:2VT4)，分辨率2.7Å^[2]。

2019年，清华大学Kobilka实验室解析了人的α2B-AR Go的复合物冷冻电镜结构，分辨率2.9 Å^[3]；2019年，PDB上发布了人α2A-AR的激活态和非激活态的晶体结构，分辨率分别为3.2 Å和2.7 Å。同年发布了人α2C-AR的晶体结构，分辨率2.8 Å。

2020年，苏黎世大学Andreas Plückthun课题组解析了人α1B-AR的反向激动剂结合的非激活态晶体结构，2.87 Å^[4]。

2011年，剑桥大学Christopher G. Tate实验室解析激动剂结合的火鸡β1-adrenergic晶体结构（PDB：2Y00），分辨率2.5Å^[5]。

2011年，斯坦福大学Kobilka实验室解析β2肾上腺素受体和G蛋白的复合物结构，激动剂BI-167107结合β2AR-Gs晶体结构（PDB：3SN6）。这个工作获得了2012年的诺贝尔化学奖^[6]。

2021年，清华大学刘翔宇课题组解析第一个人的β1-adrenergic的epinephrine和nanobody 6B9结合的激活态晶体结构3.13 Å；norepinephrine和nanobody 6B9结合的激活态2.7 Å；BI-167107和nanobody 6B9结合的激活态2.6 Å；carazolol结合的非激活态2.5 Å^[7]。

2021年，东京大学Osamu Nureki课题组解析第一个狗的β3AR冷冻电镜结构，结合mirabegron的激活态构象3.2 Å^[8]。

2023年，清华大学刘翔宇课题组解析了人α1A-AR的冷冻电镜结构，Nb29稳定的noradrenaline结合的激活态构象3.52 Å以及Nb6稳定的非激活态构象3.35 Å^[9]。

综上，β-AR的三种亚型中，人β1、β2的激活态和非激活态结构均被解析，人β3结构尚未解析。α1-AR的三种亚型中，有人α1B-AR晶体结构和α1A-AR的冷冻电镜结构报道，α1C-AR经研究表明和α1A-AR相同。α2-AR三种亚型的结构均被解析。

[1] Cherezov, V., et al. (2007). “High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.” Science 318(5854): 1258-65.
[2] Warne, T., et al. (2008). “Structure of a beta1-adrenergic G-protein-coupled receptor.” Nature 454(7203): 486-91.
[3] Yuan, D., et al. (2020). “Activation of the alpha2B adrenoceptor by the sedative sympatholytic dexmedetomidine.” Nat Chem Biol 16(5): 507-12.
[4] Deluigi, M., et al. (2022). “Crystal structure of the alpha(1B)-adrenergic receptor reveals molecular determinants of selective ligand recognition.” Nat Commun 13(1): 382.
[5] Warne, T., et al. (2011). “The structural basis for agonist and partial agonist action on a beta(1)-adrenergic receptor.” Nature 469(7329): 241-4.
[6] Rasmussen, S. G., et al. (2011). “Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.” Nature 477(7366): 549-55.
[7] Xu, X. Y., et al. (2021). “Binding pathway determines norepinephrine selectivity for the human beta(1)AR over beta(2)AR.” Cell Research 31(5): 569-79.
[8] Nagiri, C., et al. (2021). “Cryo-EM structure of the beta3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity.” Mol Cell 81(15): 3205-15 e5.
[9] Toyoda, Y., et al. (2023). “Structural basis of alpha(1A)-adrenergic receptor activation and recognition by an extracellular nanobody.” Nat Commun 14(1): 3655.

心脏保护功能

正构药物

Epi 肾上腺素

没有选择性（人在紧急情况下会同时激活b1、b2）

Norepi 去甲肾上腺素

- Binding kenetics ： kon的b1会比b2高，胞外b1的会有高的kon和结合常数  

有b1选择性（b1/b2的正构口袋是一模一样的），B1+carazolol和B1人+Bi/epi/norepi结构解析（结合口袋不能解释去甲肾上腺素的选择性/胞外的结构不一样，MD发现b1有一个很稳定的1us的构象，短暂限制在能量最低的状态），找到了6个不一样的进入氨基酸（epi一样的机制，甲基的存在自由能的变化）。相同氨基酸的周围环境不同，高分辨的结构指导助于开发出亚型选择性的药物。

Super-epi

- 苯丙氨酸5.52周围氨基酸的环境不同
- b1的高选择性激动剂，比samentrol高

别构药物

b2别构抑制剂 cmpd15

cmpd15稳定受体的非激活态，破坏了nb60的相互作用（竞争关系，结合在相同的位点），解晶体结构后发现cmd15占有率低，溶解性低，结合在胞内。进一步合成了cmpd15-PA溶解度高。发挥功能TM6向外移动，cmpd15稳定了TM6，直接和下游的转导蛋白相竞争（别构抑制剂的结合口袋都是相似的）。

b2别构激动剂 cmpd6

结合在胞内，但可以调节胞外结合的激动剂nb6b9，TM3向内，TM5、6向外移。

ligands分类

毒蕈碱受体 Muscarinic Receptor

分子机制

乙酰胆碱可激活毒蕈碱ACh受体(mAChRs)。人体内共5种。奇数亚型更喜欢与Gq/11蛋白偶联，而偶数亚型主要与Gi/o蛋白偶联。特别是，M2受体广泛分布于哺乳动物组织中，是在人类心脏中发现的唯一亚型。它在调节心脏功能方面起着关键作用。由Gi/o蛋白偶联介导的M2受体激活通常会导致心率降低和心脏收缩力降低。mAChR 是批准和研究药物的目标，用于治疗多种使人衰弱的疾病，例如精神病、阿尔茨海默病、晕动病、哮喘和失禁等。

mAChRs的纯化

mAchRs

1. construct:去除糖基化位点
2. solubilized :10uM atropine antagonist
3. soluble fraction was purified : Ni-chelating sepharose chromatography detergent exchanged to 0.01%MNG with the buffer containing an agonist iperoxo
4. soluble fraction was purified:M1 anti-FLAG immunoaffinity column
5. further purified :SEC on a superdex 200 10/300 column;10uM iperoxo
6. Monomeric fractions

mAchRs with G protein

M1R-G11iN-scFv16

1. 混合R+G: purified receptors and excess molar ratio of G-protein，The protein was incubated at room temperature for 1h added with apyrase to enzymatically removeGDP from G-protein
2. M1纯化:loaded over FLAG immunoaffinity column
   wash to the mixture of 0.00075%LMNG and 0.00025% GDN
3. Elute后加scFv16: complex was eluted with the elution buffer followed by incubation with purified scFv16 for 2h on ice
4. SEC纯化去除没结合受体:size exclusion chromatography on a superdex 200 Increase10/300 column to remove uncoupled receptor and excess scFv16
5. agonist: monomeric complex peak was collected, supplemented with 400uM iperoxo and 400uM VU0357017 for M1R-G11iN-scFv16
6. concentrated over 30mg/ml for making the cryo grid

ligands分类

GPCR 激活和 Ric-8A 分子伴侣

GPCR 激活机制

GPCR 激活后，跨膜螺旋(TMs)5和6的细胞内部分向外移动，形成一个足够大的空腔以容纳G蛋白的Gα亚基。
跨膜螺旋6(TM6)与G蛋白Gα亚基的C末端结合，稳定G蛋白的活性构象。
G蛋白的三聚体形成依赖于Ric-8A分子伴侣的帮助，Ric-8A促使Gα亚基折叠成形并形成异源三聚体结构。

Ric-8A在G蛋白激活中的作用

• Ric-8A的功能：作为鸟苷酸交换因子(GEF)，Ric-8A协助新生的Gα亚基折叠，同时增强G蛋白的活性。
• 具体机制：
  • Ric-8A识别Gα亚基并促进其折叠。
  • Ric-8A类似于GEF，可以将Gα亚基上的GDP替换为GTP，激活G蛋白。
  • Ric-8还识别Gα的C端残基，并与G蛋白亚基的GTP结合后解离，提供一种精细的质量控制机制。

GPCR的作用

• 跨膜螺旋5和6的适当折叠可以避免Gα蛋白的Ras亚基形成错误的折叠。

Ric-8A的三步作用

• 步骤一：Ric-8A作为GEF，结合新生的Gα亚基，帮助它们正确折叠，并促进信号再放大的替代模式。
• 步骤二：Ric-8识别Gα亚基的C端残基，并通过GTP与G蛋白的结合提供一个关键的质量控制机制。
• 步骤三：Ric-8的C末端与新生的GαRas结构域结合，防止Gβγ的结合并保持Gα独立。